HALO

こちらのラボではスライドスキャナーがあるので、スキャナーでスライドを取り込んでバーチャルスライドとして全体の解析が可能です。

私は今まで画像解析はImage Jで行っていたのですが、画像が大きすぎてImage Jは使えないと言われました。

Fijiで開いてみたら、開くことができたので、「できるじゃん」と一瞬思ったけれど、ものすごく粗い画像がでてきました。

サイトで確認すると、やっぱりmrxsファイルは未対応とのこと……諦めました。

 

Qupathというオープンソースのソフトウェアがあるので、そちらで解析してみようかと思ったのですが、今回私が求めている解析方法はなかなか見つからず……

 

あまり時間もないので、今回はこちらのラボで使用しているHALOを使うことにしました。

でも、いずれは帰国する予定だし、資金は潤沢ではないなので、今のうちにオープンソースのソフトウェアに慣れておきたいところ……時間ができたらもう一度調べてみよう。

 

以下は、HALOの大まかな使い方備忘録。

※ 今回は、fine neuritesをcytoplasmic inclusionと区別して、任意範囲内での面積を出したい場合の設定。

HALOの設定

Classifiers

1. Classifier Zoomは65%くらいまで。あまり大きいと「Zoom level selected significantly increases processing times」と言われる。

2. Add Class: 今回は

  • Fine Neurites
  • Cytoplasmic Inclusions
  • Nuculei
  • Glass

の4項目を指定。

3. Classify → Real-time Tuningを選択すると、四角枠の中に、AIが覚えていく内容が確認できる。

4. それぞれの項目を選択し、 その形態のものを数個ずつ指定して、AIに、指定した形態を覚えさせていく。AIは覚えた形態パターンに従って、範囲を色分けしていく。

4. 場所をずらしながら、AIのパターン認識を目視で確認し、いい感じにAIが形態パターンを覚えたと思ったら、Save Classifierで保存する。

5. 次回から、Classifier Actions → Load Classifierで呼び出せる。また、Export Classifierでエクスポートすれば、違うPCでも同じ設定が使える。

Analysis

1. Analysisに移動。

2. Settings Actions → Load SettingsでDefault Settingsを開く。

3. 今回は、Indica Labs - Area Quantification v1.0を選択。

4. Stain 1の右側にある「…」をクリック。

5. 「Click on image to select stain」と出てくるので、計測したい色(eg. DAB etc.)をクリックし、前後左右を移動させて目的の色が中央に来るようにする。

6. その状態で、pixel zoomを拡大すると、averageの色が計算される。

7. いい感じの色が設定されたら、OKをクリック。

8. Stain 2はHematoxilinの色を4 - 7の方法で選択。

9. Marker 1の「…」をクリックし、最大値、最小値、中央値を設定する。

10. Analyze → Real-time Tuningを選択し、目的の病変が目的通りにピックアップされているかどうか確認。

11. Marker 2も同様に設定。

12. Advanced → 先程Classifierで保存しておいたClassifierを選択。

13. Class Listが出てくるので、任意のものにチェックをいれる(例えばGlassとかは計測しないよね。)

14. Setting Actions → Save Settingsで保存。

15. 次回からは、Settings Actions → Load Settings → Saved Settingsから呼び出せる。また、Export Settingsでエクスポートすれば、違うPCでも同じ設定が使える。

Annotations

1. Annotationsに移動。

2. Layer Actions → New Layerで解析したい範囲の数だけLayerを作る。(今回は、海馬のGD, CA3, CA2, CA1, Subの5つを作った。)

3. Renameで各Layerに名前をつける。

4. 左の項目から、Layer 1 (GD)を選択。

5. 画面右下にあるツールを使って、ROIを選択。

6. 同様にして、他のLayerでもROIを選択。

7. Save Annotations

8. Layer Actions → Exportで出力しておく。次回から、Layer Actions → ImportでLayerの設定をインポートできる。

再びAnalysis

1. 最初に解析したいLayerを選択した状態で、Analysisに移動。

2. Analysis → Annotation Layer を選択。

3. HALOがエリア解析してくれる。

4. もしくは、Studies → Box内の解析したいImagesを選択 → Analyze Selected Images → Analysis SettingsとClassifiersをそれぞれ選択し、Annotation Layer(s)で解析したいLayerにチェックを入れる → Analyze

で一度に解析可能。

Results

1. 解析結果はResultsに表示される。

2. Object Actions → 必要な情報だけCopyするか、Exportする。

 

 

解析したい画像に対して、上記を繰り返す。

 

以上。

他の解析方法は、また必要なときに。

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