ImageJ-Fiji

以前作成した、Image Jのプロトコール。

※ Fijiのダウンロード:http://fiji.sc/Fiji

Spine DensityのCount(cell countにも使える)

  1. Confocal microscopeで撮影したImageをFijiで開く。Color mode : Grayscaleにし、Split channelsの☑を外しておく。
  2. Rectangleで、vesselsやStriosomesをよけるように選択し、Image→Crop→Save as→Tiffで保存。
  3. Image→Adjust→Threshold→Triangle, Redを選択し、Dark backgroundに☑を入れてAutoを押す。目的のものだけが選択されていたら、Applyを押す。(Methodは、Image -> Adjust -> Auto Thresholdで全Methodを一度に確認できるので、一番マッチするものを選ぶ。)
  4. Convert Stack to Binaryのウィンドウが出てくるので、Method : Triangle, Background : Lightを選択して、Stack histogramの☑を外し、「Calculate threshold for each image」「List thresholds」に☑をいれてOKする。→Auto→Apply。(大きなノンスぺは、ThresholdのMaximumを少し下げることで消せる時がある。)出てきたThresholds Listの数字を控える。
  5. Median Filterをかける。Process→Filters→Median→Radiusを0.5 pixelにする(今回はColocalization Assayを行うので、あまり大きくかけない。)。Previewに☑を入れ、確認したらApply。「Process all 2 images? There is no Undo if you select “Yes”」と出てくるのでYesを押す。
  6. 重なっている部分を分ける。Process→Binary→Watershed。「Process all 2 images? There is no Undo if you select “Yes”」と出てくるので、Yesを押す。
  7. Analyze→Analyze Particlesで解析する。Size : 0—1μ㎡。Circularity : 0.00—00、Show : Overlay Masksに設定して、Summarizeに☑を入れ、OKを押す。(Spineの幅は0.5μm程度、面積は0.25-0.1μ㎡くらい)「Process all 2 images?」と出てくるので、Yesを押す。
  8. でてきたOverlay画像を確認し、目的の部分がcountされているかどうか、違う部分が除外されているかどうかをチェックする。
  9. SummaryのそれぞれのCountを、画像左上に記載されている面積で割り、Densityを割り出す。