ImageJ-Fiji

以前作成した、Image Jのプロトコール。

※ Fijiのダウンロード:http://fiji.sc/Fiji

Intensityの求め方

  1. Confocal microscopeで撮影したImageをFijiで開く。Color mode : GrayscaleにしSplit channelsの☑を外しておく。
  2. Rectangleで、vesselsやStriosomesをよけるように選択し、Image→Crop→Save as→Tiffで保存。
  3. Image→Adjust→Threshold→Triangle, Redを選択し、Dark backgroundに☑を入れてAutoを押す。目的のものだけが選択されていたら、Applyを押す。Convert Stack to Binaryのウィンドウが出てくるので、Method : Triangle, Background : Lightを選択して、Stack histogramの☑を外し、「Calculate threshold for each image」と「List thresholds」に☑をいれてOKする。 → Auto → Apply。出てきたThreshold Listの数字は控えておく。
  4. Median Filterをかける。Process→Filters→Median→Radiusを0 pixelにする。(今回はColocalization Assayを行うので、あまり大きくかけない。)Previewに☑を入れ、確認したらApply。「Process all 2 images ? There is no Undo if you select “Yes”」と出てくるのでYesを押す。
  5. Image → Color → Split Channelsを選択し、それぞれの画像に分ける。それぞれの画像に対して、以下の作業を進める。
  6. Edit → Selection → Create Selection(黒の周りが黄色の線で囲まれる。)
  7. 保存した場所から、もう一度同じ画像を開く。Split channelsに☑をいれておく。commentが出てこなかったら、Image→Color→Split Channelsでチャネルを分ける。
  8. 対応する画像を選択し、Edit → Selection → Restore selection(ひとつ前に作った選択範囲を適用する。)
  9. Analyze → Measureで測定する。ResultsのMeanとAreaの値を控える。(Analyze → Set Measurementsで、Area, Min&max gray value, Mean gray valueに☑を入れておく。)
  10. Edit → Selection → Select Noneを選択し、Selectionを外す。
  11. もう一度Analyze → Measureで測定し、Minの値を控える。SelectionのMean gray valueからBackgroundのMin gray valueをひく。(すべての画像をSaturationする直前まで上げているので、画像同士を比較する場合、それぞれのBackgroundで引いた方がよい。)これにより、全てのPunctaの平均Intensityを計算する。
  12. 出てきた数字をAreaで割る。
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