ImageJ-Fiji

以前作成した、Image Jのプロトコール。

※ Fijiのダウンロード:http://fiji.sc/Fiji

Colocalization Assay

1.      Confocal microscopeで撮影したImageをFijiで開く。

2.      Rectangleで、vesselsやStriosomesをよけるように選択し、

Image → Crop → Save as → Tiffで保存。

3.      Image → Adjust → Threshold → Triangle, Redを選択し、

Dark backgroundに☑を入れてAutoを押す。

目的のものだけが選択されていたら、Applyを押す。

Convert Stack to Binaryのウィンドウが出てくるので、

Method : Triangle, Background : Lightを選択して、

Stack histogramの☑を外し、

「Calculate threshold for each image」と「List thresholds」に☑をいれて

OKする。

→ Auto → Apply。

出てきたThreshold Listの数字は控えておく。

 

4.      Median Filterをかける。

Process → Filters → Median → Radiusを1.0 pixelにする。

(今回はColocalization Assayを行うので、あまり大きくかけない。)

Previewに☑を入れ、確認したらApply。

「Process all 2 images ? There is no Undo if you select “Yes”」

と出てくるのでYesを押す。

 

5.      Image → Color → Split ChannelsでChannelを分割する。

 

6.      Process → Image Caluculatorを選択する。

Image 1とImage 2にそれぞれの画像を選択し、

Operationは「And」にする。

Create new windowに☑をいれ、OKを押す。

(黒い部分がcolocalizationしているところ。)

 

7.      重なっている部分を分ける。

Process → Binary → Watershed

 

8.      Analyze → Analyze Particlesで解析する。

Size : 0–1μ㎡。Circularity : 0.00–1.00、Show : Overlay Masksに設定して、

Summarizeに☑を入れ、OKを押す。

(Spineの幅は0.5μm程度、面積は0.25-0.1μ㎡くらい)

 

9.      でてきたOverlay画像を確認し、

目的の部分がcountされているかどうか、

違う部分が除外されているかどうかをチェックする。

 

10.    SummaryのCountを、

画像左上に記載されている面積で割り、

Densityを割り出す。

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