以前作成した、Image Jのプロトコール。
※ Fijiのダウンロード：http://fiji.sc/Fiji
Colocalization Assay
1. Confocal microscopeで撮影したImageをFijiで開く。
2. Rectangleで、vesselsやStriosomesをよけるように選択し、
Image → Crop → Save as → Tiffで保存。
3. Image → Adjust → Threshold → Triangle, Redを選択し、
Dark backgroundに☑を入れてAutoを押す。
目的のものだけが選択されていたら、Applyを押す。
Convert Stack to Binaryのウィンドウが出てくるので、
Method : Triangle, Background : Lightを選択して、
Stack histogramの☑を外し、
「Calculate threshold for each image」と「List thresholds」に☑をいれて
OKする。
→ Auto → Apply。
出てきたThreshold Listの数字は控えておく。
4. Median Filterをかける。
Process → Filters → Median → Radiusを1.0 pixelにする。
（今回はColocalization Assayを行うので、あまり大きくかけない。）
Previewに☑を入れ、確認したらApply。
「Process all 2 images ? There is no Undo if you select “Yes”」
と出てくるのでYesを押す。
5. Image → Color → Split ChannelsでChannelを分割する。
6. Process → Image Caluculatorを選択する。
Image 1とImage 2にそれぞれの画像を選択し、
Operationは「And」にする。
Create new windowに☑をいれ、OKを押す。
（黒い部分がcolocalizationしているところ。）
7. 重なっている部分を分ける。
Process → Binary → Watershed
8. Analyze → Analyze Particlesで解析する。
Size : 0–1μ㎡。Circularity : 0.00–1.00、Show : Overlay Masksに設定して、
Summarizeに☑を入れ、OKを押す。
（Spineの幅は0.5μm程度、面積は0.25-0.1μ㎡くらい）
9. でてきたOverlay画像を確認し、
目的の部分がcountされているかどうか、
違う部分が除外されているかどうかをチェックする。
10. SummaryのCountを、
画像左上に記載されている面積で割り、
Densityを割り出す。
